Use of Gentamicin in rats as a model of damage in inner ear hair cell regeneration studies

  • Sebastián Silva Facultad de Medicina, Universidad de Chile
  • Javiera Pardo
  • Manuel Kukuljan Facultad de Medicina, Universidad de Chile
  • Juan Cristóbal Maass Clinica Alemana de Santiago, Facultad de Medicina Clinica Alemana, Universidad del Desarrollo, Santiago, Chile

Resumen

Tanto nosotros como todos los mamíferos no presentamos regeneración celular espontánea en el oído interno. Por lo tanto, el daño auditivo es irreversible. Pero en individuos jóvenes existe un potencial regenerativo latente manipulable genéticamente para inducir proliferación en células de soporte y trans-diferenciación de células de soporte en células ciliadas. Lamentablemente esta
posibilidad disminuye con la edad, por lo que es importante entender este proceso. La presencia de células ciliadas modula la expresión génica y el destino celular de los demás tipos celulares en la cóclea. El daño auditivo principalmente afecta las células ciliadas y de esta manera modifica la expresión génica del oído interno, aumentando el potencial regenerativo. Sin embargo, las células cuando son más reactivas a las modificaciones genéticas también son menos susceptibles al daño. Por todo esto, para estudiar la regeneración de las células ciliadas es importante tener modelos para inducir daño que afecte preferentemente a las células ciliadas preservando las células de sostén cuando el oído interno es aún joven y tiene un mayor potencial de regeneración. Una forma de eliminar células ciliadas es mediante el uso de aminoglicósidos, que dañan predominantemente las células ciliadas internas una vez iniciada su función al décimo día de vida en roedores. Pero de producirse un daño severo, este también disminuye el número de células de sostén y por tanto el potencial regenerativo también disminuye ya que no hay buen material de partida para regenerar. El objetivo de este estudio es establecer modelos in vitro e in vivo de daño al órgano de Corti para estudiar regeneración durante el desarrollo postnatal temprano de los roedores antes de la primera semana de vida y del inicio de la audición cuando el potencial regenerativo es más alto.


Explantes cocleares de neonatos de cero a tres días de vida (P0 a P3) fueron tratados con 320 a 640 μM de gentamicina durante 24 a 48 horas iniciales de cultivo y después mantenidas en cultivo durante un máximo de 6 días. Neonatos de rata P0 a P3 fueron tratados in vivo con gentamicina 80 mM administrada directamente a la ventana redonda y a la escala media después de un abordaje microquirúrgico evaluándose después de 4 días. El daño coclear fue evaluado por inmunofluorescencia contra Miosina VI (marcador de células ciliadas), Sox2 (marcador de células de soporte) y activo Caspasa 3 (marcador de apoptosis). Se añadió DAPT 10μ M para la inducción de la trans-diferenciación celular posterior al daño. La administración in vivo de gentamicina no produjo muerte celular en el órgano de Corti. En cambio los explantes cocleares mostraron una importante sensibilidad in vitro a gentamicina. Se logró trans-diferenciación exitosa después de 48 horas de co-cultivo con DAPT en explantes P1. Con 640 μM, los números y la morfología de las células ciliadas remanentes y las células de soporte se vieron seriamente afectados en P0 después de 3 días in vitro. Con 320 μM el número de células ciliadas fue disminuido moderadamente en P0, pero las células de sostén se conservaron en mejores condiciones. Se concluye que la gentamicina induce la muerte celular en cultivo de explantes cocleares antes de P3 pero no in vivo. El daño producido en el órgano de Corti es dependiente de la dosis. 320 μM es una dosis de gentamicina que, en el cultivo, daña preferentemente las células ciliadas sobre células de soporte en cultivo. Es posible utilizar gentamicina in vitro para inducir daño coclear en estudios de regeneración realizados en etapas tempranas del desarrollo postnatal y antes de la maduración que involucra el inicio de la audición.


Abstract
In rodents as across the mammals there is no spontaneous inner ear hair cell regeneration, but there is a regenerative potential of inducing proliferation of supporting cells and trans-differentiation of supporting cells into hair cells after modifying the gene expression pattern in young animals. The presence of hair cells modulates the gene expression and cell fate of other cochlear cell types. Inner ear gene expression in the inner ear epithelium is modified by damage in mammals. The regenerative potential is grater when hair cell damage is induced. After the hair cell function is fully established the aminoglicosides antibiotics are strong ototoxic drugs but the regenerative potential is severely decreased. Therefore in order to study hair cell regeneration it is important to have models to induce damage preferentially affecting the hair cells and preserving supporting cells when the inner ear has the highest potential of regeneration. The aim of this study is to establish in vitro and in vivo models of damage to study organ of Corti regeneration during the early postnatal development before the first week of rodent life and the start of hearing. Rat P0 to P3 explants were treated with 320 to 640μM Gentamicin for the initial 24 to 48 hours of culture and then incubated for up to 6 days. Rat P0 to P3 neonates were treated with 80mM Gentamicin directly administered to the round window or the scala media after a microsurgical approach and evaluated after 4 days. The cochlear damage was assessed by Myosin VI (hair cell marker), Sox2 (supporting cell marker) and active Caspase 3 (apoptosis marker) immunostainings. DAPT 10μM was added for further hair cell transdiferentiation induction. In vivo the administration of Gentamicin did not produce any amount of cell death in the organ of Corti. Rats cochlear explants exhibited important in vitro sensitivity to Gentamicin. Successful trans-differentiation was achieved after 48 hours of co-culture with DAPT in P1 explants. With 640μM the numbers and the morphology of the remnant hair cells and supporting cells was severely affected at P0 after 3 days in vitro. With 320 μM the number of hair cells was moderately decreased at P0 but the supporting cells were preserved in better condition. We conclude that Gentamicin induces cell death in cochlear explants culture before P3 but not in vivo. The organ of Corti’s damage is dose dependent. 320 μM is a Gentamicin dose that in culture preferentially damage hair cells over supporting cells in culture. It is possible to use Gentamicin in vitro to induce cochlear damage in regeneration studies performed in early stages of postnatal development and before the maturation that involves the onset of hearing.

Biografía del autor

Sebastián Silva, Facultad de Medicina, Universidad de Chile

Audition and Cognition Center (AUCO)
Interdisciplinary Program of Physiology and Biophysics, ICBM, Faculty of Medicine, Universidad de Chile

Javiera Pardo

Audition and Cognition Center (AUCO)

Manuel Kukuljan, Facultad de Medicina, Universidad de Chile

Interdisciplinary Program of Physiology and Biophysics, ICBM, Faculty of Medicine, Universidad de Chile

Juan Cristóbal Maass, Clinica Alemana de Santiago, Facultad de Medicina Clinica Alemana, Universidad del Desarrollo, Santiago, Chile

Audition and Cognition Center (AUCO)
Interdisciplinary Program of Physiology and Biophysics, ICBM, Faculty of Medicine, Universidad de Chile
Department of Otolaryngology, Hospital Clínico Universidad de Chile
Departament of Surgery, Otolaryngology Unit, Clínica Alemana de Santiago, Universidad del Desarrollo

Publicado
2017-09-15
Cómo Citar
SILVA, Sebastián et al. Use of Gentamicin in rats as a model of damage in inner ear hair cell regeneration studies. Contacto Científico, [S.l.], v. 7, n. 4, sep. 2017. ISSN 0719-045X. Disponible en: <http://contactocientifico.alemana.cl/ojs/index.php/cc/article/view/524>. Fecha de acceso: 24 oct. 2017
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Contribución Original